免疫沉淀技術(shù)

免疫沉淀原理：
免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)如“proteinA”特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象而開發(fā)出來的分離抗原的免疫學(xué)方法。目前多用的“proteinA”等預(yù)先結(jié)合固化在Agarosebeads上，使之與含有抗原的溶液幾抗體反應(yīng)后，beads上的proteinA就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。（如圖1）

二、免疫沉淀實(shí)驗(yàn)方案（供實(shí)驗(yàn)者參考）：
（一）實(shí)驗(yàn)材料
試劑及緩沖液：①細(xì)胞裂解產(chǎn)物（樣品）；②ProteinGorProteinAslurry；③一抗；④細(xì)胞裂解緩沖液；⑤PBS；⑥SDS-PAGEsamplebuffer；⑦蛋白酶抑制劑
設(shè)備：①離心機(jī)；②搖床或rotator

（二）實(shí)驗(yàn)方法：
A)樣品（細(xì)胞裂解物）準(zhǔn)備
1.收集約107細(xì)胞。
（注：1ml體積中所含細(xì)胞總數(shù)和合適的凝膠上樣量取決于不同蛋白以及其抗體的特性）
2.加入約10ml的PBS到錐形管中，并用400×g離心10分鐘洗滌細(xì)胞。
3.棄去上清液并重復(fù)第2步洗滌細(xì)胞。
（注：對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)皿中的單層貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液后，用PBS洗滌兩次，盡量避免破壞細(xì)胞層）
4.完全棄去上清液后，加入1ml預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑（ProteaseinhibitorCocktail）的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞。小心地vortex混勻.
（注：為防止蛋白酶的作用，細(xì)胞裂解液應(yīng)當(dāng)預(yù)冷。所有接下來的操作都在低溫條件下進(jìn)行，并且蛋白酶抑制劑預(yù)先添加到細(xì)胞裂解液中;此步驟對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)皿中的單層貼壁細(xì)胞，可在10cm的培養(yǎng)皿中加入1ml預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解）。
5.把錐形管或培養(yǎng)皿放在冰上孵育30分鐘，并間斷性地混勻。
6.4℃，10000×g離心細(xì)胞裂解物15分鐘。
7.小心地收集上清液轉(zhuǎn)置干凈的管中備用；此樣品可凍存于-80℃作長(zhǎng)期保存。

B）樣品的預(yù)清洗(可選做)
1.在eppendorf管中加入50ulProteinGbeadslurry，并加入450ul預(yù)冷的細(xì)胞裂解液。10000×g離心30秒后棄去細(xì)胞裂解液;用500ul預(yù)冷的細(xì)胞裂解液重復(fù)洗滌一次，最后用50ul預(yù)冷的細(xì)胞裂解液重懸微球。
2.把洗滌好的50ulProteinGbead加入到盛有500ul細(xì)胞裂解樣品的eppendorf管中，于冰上孵育30-60分鐘。
3.4℃，10000×g離心10分鐘后把上清液轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管。若轉(zhuǎn)移過來的上清液中仍含有ProteinGbead，可以再次離心處理后小心地轉(zhuǎn)移上清到另一新的eppendorf管。

C）免疫沉淀
1.在盛有預(yù)清洗的細(xì)胞裂解樣品的eppendorf管中加入5-10ug相應(yīng)抗體。
（注：抗體的濃度是影響免疫沉淀反應(yīng)的重要因素；建議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出合適的使用濃度）
2.4℃孵育1小時(shí)。
3.加入50ul預(yù)洗的ProteinGbeadslurry（微珠處理參考上面樣品的預(yù)清洗中第一步方法）。
4.于4℃旋轉(zhuǎn)混勻孵育1小時(shí)。
5.4℃，10000×g離心eppendorf管30秒。
6.小心并盡量完全地移除上清液后用500ul的細(xì)胞裂解液洗滌微珠3-5次；為減少非特異背景影響，每次洗滌都要盡量小心并完全地移除上清液。
7.最后一次洗滌并棄去上清液后加入50ul的Laemmlisamplebuffer工作液。旋渦混勻后加熱至90-100℃十分鐘。
8.10000×g離心5分鐘，收集上清液。取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時(shí)不用的樣品可以-20℃保存。
9.按照電泳說明進(jìn)行SDS-PAGE電泳。染膠分析沉淀蛋白。
（注：如果接下來用于免疫印跡（WB）分析，則按相應(yīng)的WB操作步驟繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。推薦用eBioscience的TrueBlotTM可以得到更佳WB的效果；WB的抗體使用濃度和免疫沉淀的濃度不同，需視具體情況而定，這里建議應(yīng)用不同克隆號(hào)的抗體。）

三、附錄：
（1）緩沖液的制備參考
NP-40CellLysisBuffer:
50mMTris-HclpH8.0
150mMNacl
1%NP-40
ProteaseinhibitorCocktail:
PMSF,5mg(50ug/ml)
Aprotinin,100ug(1ug/ml)
Leupeptin,100ug(1ug/ml)
Pepstatin,100ug(1ug/ml)
100%Ethanolbringupto1ml,aliquot

（2）免疫沉淀（IP）的常見問題及解答

1.用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實(shí)驗(yàn)？
答：抗體的性質(zhì)對(duì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)影響很大?？贵w不同，和抗原以及ProteinG或ProteinA的結(jié)合能力也就不同。所以一般免染能結(jié)合的抗體未必能用于IP反應(yīng)。
一般來說，多抗是沉淀反應(yīng)更好的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2.為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑？
答：從活性細(xì)胞裂解出來的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預(yù)檢測(cè)蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？
答：多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合。

4.免疫沉淀實(shí)驗(yàn)應(yīng)如何把握抗體和緩沖液的比例？
答：每次沉淀實(shí)驗(yàn)之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。

5.免疫沉淀應(yīng)該如何配制細(xì)胞裂解液？
答：適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和;DOC(sodiumde-oxycholate)，SDS是離子性的強(qiáng)活性劑。所以裂解液的配制時(shí)所用去污劑的種類和濃度以及鹽濃度等條件需實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行優(yōu)化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體完全失去活性。