ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化的建立

為了實現(xiàn)ELISPOT的標(biāo)準(zhǔn)化，顯色最好在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在25°C±5°C，顯色25分鐘為宜。另外，在37°C顯色也是不錯的一個方法，但要注意相應(yīng)的縮短顯色時間到12-18分鐘，并且顯色中勤檢查。為了提高ELISPOT檢測結(jié)果的可重復(fù)性，增加實驗的可信度，必須建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的實驗操作規(guī)范。標(biāo)準(zhǔn)化的實驗操作規(guī)范不僅僅是一些實驗操作，更是一個系統(tǒng)工程，需要提升到實驗室管理與制度架構(gòu)上來建設(shè)。這包括實驗室制度的建立，實驗人員的培訓(xùn)，實驗程序的建立和標(biāo)準(zhǔn)化，實驗設(shè)備、試劑、耗材的選擇與標(biāo)準(zhǔn)化等等。單就實驗流程而言，標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范從實驗樣品的采集階段就開始了，一直延續(xù)到整個實驗的結(jié)束，即數(shù)據(jù)分析處理的完成。參見圖1。

如右圖所示，影響到ELISPOT斑點頻率的因素很多，我們來逐一分析。

細(xì)胞類型
通常我們用來做ELISPOT檢測的細(xì)胞有血液來源的PBMC和脾臟來源的淋巴細(xì)胞。也有的實驗者需要用到骨髓細(xì)胞。來源不同，細(xì)胞的組成就有差別，所以要考慮到這些差別，不能直接作比較。是哪些因素導(dǎo)致了細(xì)胞來源不同，ELISPOT結(jié)果就不同呢？

一個因素是陽性細(xì)胞在生物體內(nèi)的分布。我們知道，細(xì)胞免疫往往發(fā)生在局部的免疫反應(yīng)部位。比如發(fā)生粘膜免疫時，各種免疫細(xì)胞就會富集在粘膜器官；發(fā)生自身免疫反應(yīng)時，致敏細(xì)胞也往往集中在受累器官。所以，局部器官的淋巴細(xì)胞中陽性細(xì)胞的比例與血液或者脾臟中陽性細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例可能是不相同的。血液與脾臟之間也可能有差別。

另一個因素是APC的含量。不同組織器官來源，甚至不同的分離方法，在淋巴細(xì)胞中混合的APC細(xì)胞含量也有差異。極端情況（比如待測細(xì)胞是經(jīng)過磁珠純化的）APC含量不足，需要添加APC（人工培養(yǎng)的DC細(xì)胞或者“飼養(yǎng)細(xì)胞”）。這方面的詳細(xì)情況參見第四節(jié)。 
所以，標(biāo)準(zhǔn)化必須考慮細(xì)胞類型和細(xì)胞組成。

細(xì)胞狀態(tài)
細(xì)胞狀態(tài)是體現(xiàn)實驗者技術(shù)水平與經(jīng)驗實力的試金石。很多實驗者問我，為什么有些人的ELISPOT結(jié)果做得非常好，而另外有些人的結(jié)果卻做得非常糟。略去客觀因素不談，主觀因素主要體現(xiàn)在對檢測細(xì)胞的處理上。有些人有長期養(yǎng)細(xì)胞和做細(xì)胞學(xué)實驗的基礎(chǔ)，處理細(xì)胞來得心應(yīng)手，獲得的細(xì)胞狀態(tài)好，活力高，ELISPOT檢測的結(jié)果自然就好。反之，有些細(xì)胞還沒拿去做ELISPOT檢測之前，已經(jīng)被折騰得死去大半或者奄奄一息了，這樣能做出好的實驗結(jié)果來嗎？！

細(xì)胞狀態(tài)涉及到細(xì)胞來源（包括組織取樣）、細(xì)胞分離的方法、以及細(xì)胞是否需要凍存復(fù)蘇等諸方面。關(guān)于保持良好細(xì)胞狀態(tài)的內(nèi)容參見第四節(jié)；關(guān)于細(xì)胞分離方法的內(nèi)容參見第六節(jié)；關(guān)于細(xì)胞凍存復(fù)蘇方面的內(nèi)容參見第七節(jié)。

這些環(huán)節(jié)都要做到標(biāo)準(zhǔn)化，細(xì)胞狀態(tài)才有保證，實驗結(jié)果的重復(fù)性與可信度才有保證。

細(xì)胞計數(shù)
細(xì)胞計數(shù)看起來很簡單，很多實驗者都忽視它。但是它對ELISPOT結(jié)果可信度與重復(fù)性的影響是怎么強(qiáng)調(diào)也不過分的。因為ELISPOT檢測的是細(xì)胞頻率，分子式斑點的數(shù)目，分母是細(xì)胞的數(shù)目。如果經(jīng)過千辛萬苦，我們把分子（也就是斑點）弄得很漂亮，也弄得很準(zhǔn)確，但是分母卻給忽略了，那這個分?jǐn)?shù)值（陽性細(xì)胞頻率）能準(zhǔn)確嗎？

我們達(dá)科為對此有刻骨銘心的感受。我們公司在05-06年曾經(jīng)有一個ELISPOT研究項目，就是研究相同的凍存細(xì)胞與刺激物在不同的實驗室是否能做出相同的結(jié)果。我們下了很大的功夫去研究細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇，研究凍存細(xì)胞在國內(nèi)的長途運輸，也下了很大功夫去培訓(xùn)參與實驗的各個實驗室的人員技術(shù)與資質(zhì)。最后做出來的實驗結(jié)果單從斑點與背景上來看無可挑剔，但是有兩個實驗室的數(shù)據(jù)與其它八個實驗室的數(shù)據(jù)有較大差異。最后經(jīng)過詳細(xì)的排查，原因竟然出現(xiàn)在血球計數(shù)板上！這兩家實驗室的血球計數(shù)板質(zhì)量差，誤差大，導(dǎo)致最后細(xì)胞計數(shù)誤差竟然達(dá)到±40%！

細(xì)胞計數(shù)最常見的裝備是血球計數(shù)板，雖看看起來不是什么高、精、尖設(shè)備，但是也代表了一個國家玻璃精加工的水平。我國能夠研制精密的大功率固體激光器，也有水平做出高質(zhì)量的血球計數(shù)板。可惜的是有能力不一定有愿望，目前國產(chǎn)的各種血球其數(shù)板經(jīng)過測試都存在較大的誤差。建議還是購買進(jìn)口的血球計數(shù)板，確實好用。如果一定要用國產(chǎn)的，那請堅持使用同一塊血球計數(shù)板。

細(xì)胞稀釋也必須認(rèn)真仔細(xì)，取樣之前注意混勻。做重要實驗的時候，最好讓兩個人獨立稀釋和計數(shù)，結(jié)果相差要控制到10%以內(nèi)。

刺激物、試劑盒與血清
實驗要取得重復(fù)性，刺激物的刺激效果必須要可重復(fù)、可再現(xiàn)。一批刺激物用完之后，換下一批刺激物的時候，要做驗證性試驗。另外，有些多肽、蛋白類的刺激物可能在保存的過程中會失活、降解，反復(fù)凍融也會造成問題。這就要求預(yù)先擬定好刺激物的保存計劃，時隔三個月或者半年就要做一次驗證性的實驗。相關(guān)內(nèi)容參見第四節(jié)。

目前市場上的ELISPOT試劑盒都是來自國際知名的公司，不同公司的試劑盒采用的抗體質(zhì)量都是有保證的。但是大家往往忽略了抗體之外的其他成分，比如封閉液、抗體稀釋液等等。這些也輔助試劑會造成顯著的差別。在追求實驗結(jié)果的重復(fù)性與可信度的時候，必須引起重視。

血清與內(nèi)毒素當(dāng)然是一個重要影響因素，為了實現(xiàn)ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化，提高實驗的可信度與重復(fù)性，根本之道是采用無血清ELISPOT技術(shù)。相關(guān)內(nèi)容參見第三節(jié)和第五節(jié)。

實驗操作流程與斑點顯色
本手冊的第三節(jié)就是ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，只要遵照執(zhí)行，應(yīng)該沒有什么問題。但是有一點需要引起重視，那就是標(biāo)準(zhǔn)化同時也是固定化。往往一個實驗操作步驟有很大的彈性空間，可以這樣做也可以那樣做。如果較真起來，這些做法都有像它的道理，理論與實驗也不能證明誰比誰更優(yōu)。這才是他們得以同時保留下來的原因。但是一旦實驗室的操作方法固定下來，就不要隨意更改，即便是“等效”的操作也不要隨意變化。標(biāo)準(zhǔn)化其實也是固定化。只要標(biāo)準(zhǔn)操作方案沒有錯誤，就要嚴(yán)格執(zhí)行。

斑點顯色之所以從實驗流程中單列出來，是因為它的重要性。目前ELISPOT有三套顯色系統(tǒng)，一套是PVDF膜上的HRP/AEC顯色系統(tǒng)，顯紅色的斑點；一套是PVDF膜上的AP/BCIP·NBT顯色系統(tǒng)，顯藍(lán)色的斑點；一套是透明板上的GABA/銀染系統(tǒng)，顯黑色的斑點。應(yīng)該說這些顯色系統(tǒng)之間的靈敏度與背景控制都沒有顯著的差別，但是一旦選定一種顯色系統(tǒng)之后，最好長期堅持，以滿足標(biāo)準(zhǔn)化的需要。 
顯色問題除了顯色系統(tǒng)的選擇之外，還要注意顯色溫度與顯色時間。顯色是所有ELISPOT操作中唯一在“室溫”完成的操作步驟。但是，請注意生物學(xué)與化中的“室溫”是有嚴(yán)格所指的25°C±5°C，而不是籠而統(tǒng)之的所謂“室內(nèi)溫度”。進(jìn)入秋冬季以來，我們接到大量客戶電話，說ELISPOT斑點顏色淺，懷疑是不是抗體失活。有意思的是，這些客戶多數(shù)集中在長江流域。經(jīng)過仔細(xì)核實，他們的問題幾乎都是由于冬季室內(nèi)沒有暖氣，室溫過低導(dǎo)致的顯色不足。特別注意：一旦顯色進(jìn)行了10分鐘以上，再提高溫度就沒什么意義了，因為酶已經(jīng)大部分失活。

為了實現(xiàn)ELISPOT的標(biāo)準(zhǔn)化，顯色最好在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在25°C±5°C，顯色25分鐘為宜。另外，在37°C顯色也是不錯的一個方法，但要注意相應(yīng)的縮短顯色時間到12-18分鐘，并且顯色中勤檢查。

斑點計數(shù)與數(shù)據(jù)處理
什么樣的點判定為ELISPOT有效斑點，什么樣的點不判定或者盤點為無效點，這就是斑點計數(shù)的“尺度”。為了實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，必須統(tǒng)一“尺度”，不能搞“雙重標(biāo)準(zhǔn)”。統(tǒng)一尺度的前提是采用機(jī)器自動計數(shù)。例如在BioReader4000上，我們一共有十多項獨立的參數(shù)，用來描述和判定斑點。這些參數(shù)可以單獨保存為“方法文件”。只要“方法文件”中的參數(shù)相同，斑點計數(shù)的“尺度”也就相同，標(biāo)準(zhǔn)化的斑點計數(shù)就有保障。

數(shù)據(jù)處理，包括數(shù)據(jù)綜合，陰陽性判斷，數(shù)理統(tǒng)計等等。不論怎么處理，應(yīng)該采取相同的處理方法，這沒有疑問。

綜上所述，ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化的思想就是：在ELISPOT實驗的每一個環(huán)節(jié)都采用切實有效的步驟和方法，并且固定下來，從而最終保證實驗結(jié)果的重復(fù)性與可信度。