【文獻(xiàn)分享】泛組蛋白脫乙?；敢种苿┛稍鰪?qiáng)實(shí)體瘤中B7-H3特異性CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性

引導(dǎo)語(yǔ)：

2021年6月23日，中國(guó)首款CAR T藥-阿基侖賽注射液獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市。這是一種自體免疫細(xì)胞注射劑，由攜帶CD19 CAR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因修飾的自體靶向人CD19嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR T）制備，用于治療既往接受二線或以上系統(tǒng)性治療后復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤成人患者，這將開啟中國(guó)腫瘤細(xì)胞治療的新未來。

CAR T技術(shù)出現(xiàn)了多年并經(jīng)歷了諸多改進(jìn)才逐漸進(jìn)入臨床，除了被用來治療急性白血病和非霍奇金淋巴瘤，改進(jìn)后也被用來治療實(shí)體瘤、自身免疫疾病、HIV感染和心臟病等疾病。近年來，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多關(guān)于CAR T細(xì)胞的研究和報(bào)導(dǎo)。2021年4月2日，在期刊Clinical Cancer Research（影響因子IF=10.107）發(fā)表了一篇標(biāo)題為“A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-Specific CAR T Cells in Solid Tumors”的論文，研究泛組蛋白脫乙酰基酶抑制劑對(duì)實(shí)體瘤中B7-H3.CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性的影響。

接下來小編就給大家介紹一下這篇高分文獻(xiàn)。

一、B7-H3在實(shí)體癌細(xì)胞上的表達(dá)及其與多種實(shí)體癌患者生存率的關(guān)系

B7-H3，也稱為CD276，它是一種免疫檢查點(diǎn)分子，屬于免疫檢查點(diǎn)抑制劑B7超家族。它的生物學(xué)特性功能目前尚不清楚，它的功能是共刺激或者共抑制分子取決于它所參與的免疫反應(yīng)。在這篇文章，作者為了測(cè)試表觀遺傳療法是否可以增強(qiáng) B7-H3.CAR T細(xì)胞對(duì)多種實(shí)體癌類型的抗腫瘤活性，通過in vitro和ex vitro實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了B7-H3.CAR T 細(xì)胞和脫乙酰酶抑制劑 (SAHA) 聯(lián)合治療幾種實(shí)體癌的療效和潛在機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B7-H3 在大多數(shù)人實(shí)體瘤樣本中會(huì)表達(dá)，但在正常組織中表達(dá)受限，B7-H3.CAR T 細(xì)胞在體外選擇性殺死表達(dá) B7-H3 的人癌細(xì)胞系。

作者采用中山紀(jì)念醫(yī)院和中山大學(xué)自2007年4月至2013年12月期間收集的186例三陰性乳腺癌（TNBC）樣本，298例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）標(biāo)本樣本，152個(gè)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）樣本和89例皮膚黑色素瘤（SKCM）樣本用于B7-H3染色和分析。另外，采用中山紀(jì)念醫(yī)院和中山大學(xué)自2016年5月至2018年11月期間收集的47例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌樣本和39例三陰性乳腺癌樣本建立病人來源的異種移植模型。采用50ml健康獻(xiàn)血者的外周血，以及70ml頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者和三陰性乳腺癌患者的外周血建立這兩種癌癥細(xì)胞系，建議TNBC-S3和HNSCC-Y2細(xì)胞系，以產(chǎn)生CAR T細(xì)胞。

首先，作者評(píng)估了B7-H3在實(shí)體癌和正常組織中的表達(dá)。如圖1所示，B7-H3廣泛表達(dá)于多種實(shí)體癌，但在正常組織有限表達(dá)。低表達(dá)B7-H3的TNBC，HNSCC，以及SCLC癌癥患者的存活率更長(zhǎng)。B7-H3表達(dá)升高與腫瘤患者的短存活率有關(guān)。因此，B7-H3不僅是實(shí)體癌的一個(gè)預(yù)后生物標(biāo)志物，而且是腫瘤免疫治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

圖1：B7-H3在實(shí)體癌細(xì)胞上的表達(dá)及其與多種實(shí)體癌患者生存率的關(guān)系。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

二、脫乙酰酶抑制劑 (SAHA)可顯著增加多種人實(shí)體癌細(xì)胞的B7-H3的表達(dá)

實(shí)體瘤中的抗原異質(zhì)性是CAR T細(xì)胞的免疫治療的主要障礙之一。抗原豐富區(qū)域促進(jìn)了CAR T細(xì)胞的招募以及CAR T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的相互作用。組蛋白脫乙酰基酶抑制劑已經(jīng)被證明可以有效的上調(diào)轉(zhuǎn)錄激活。因此，作者檢測(cè)了組蛋白脫乙?；敢种苿┦欠衲茉鰪?qiáng)B7-H3在實(shí)體癌細(xì)胞中的表達(dá)。如圖2?？紤]到劑量限制毒性和其他臨床試驗(yàn)中觀察到的與組蛋白脫乙?；敢种苿┫嚓P(guān)的不良反應(yīng)，作者篩選了一系列的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAHA可以最有效的上調(diào)B7-H3的表達(dá)，如0.5 mmol/L的SAHA可以誘導(dǎo)B7-H3表達(dá)水平上調(diào)兩倍，并且SAHA可以上調(diào)B7-H3轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。同時(shí)檢測(cè)了B7-H3在經(jīng)SAHA處理的多種正常人細(xì)胞上的表達(dá)，包括原代舌肌細(xì)胞，原代胃上皮細(xì)胞細(xì)胞，原代十二指腸細(xì)胞，原代肝細(xì)胞，原代胰腺細(xì)胞和原代卵巢細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SAHA沒有增加B7-H3在人類正常細(xì)胞表面的表達(dá)。

圖2：SAHA通過組蛋白修飾顯著增加了多種人實(shí)體癌B7-H3的表達(dá)。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

三、SAHA可顯著增強(qiáng)實(shí)體瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的B7-H3. CAR T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性

如圖3，相比于未預(yù)處理的癌細(xì)胞，SAHA預(yù)處理的CAR T細(xì)胞共培養(yǎng)的癌細(xì)胞，經(jīng)過24小時(shí)的孵育后，細(xì)胞上清中四種細(xì)胞因子：GMCSF，IFNγ，IL2和TNFα顯著增加。說明SAHA可增強(qiáng)實(shí)體癌細(xì)胞對(duì)B7-H3.CAR T細(xì)胞的敏感性，并增強(qiáng)B7-H3.CAR T細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞毒活性。

圖3：SAHA可增強(qiáng)實(shí)體癌細(xì)胞對(duì)B7-H3.CAR T細(xì)胞的敏感性，并增強(qiáng)B7-H3.CAR T細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞毒活性。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

四、SAHA可抑制B7-H3.CAR T免疫抑制信號(hào)通路以及增強(qiáng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路

作者進(jìn)行mRNA分析以檢測(cè)B7-H3.CAR T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在SAHA處理下的變化。如圖4，SAHA顯著改變了轉(zhuǎn)錄組，有6172個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，6225個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。然后，采用基因富集分析去鑒定CAR T改變的細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的基因上調(diào)，而與免疫抑制和未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)相關(guān)的基因下調(diào)。

甲基胞嘧啶二氧酶（TET2）在最近的研究中證明可以有效調(diào)節(jié)CD19.CAR T細(xì)胞。因此，作者研究了TET2的潛在作用。如圖4 E–I，敲除B7-H3.CAR T細(xì)胞的TET2后，CAR T細(xì)胞釋放的四種細(xì)胞因子GM-CSF，IFN-γ，IL-2, TNF-α增多，細(xì)胞的毒性活性增加，釋放的穿孔素和顆粒酶B也增多。因此，SAHA可以通過上調(diào)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路增加T細(xì)胞表面B7-H3.CAR的表達(dá)。此外，SAHA還會(huì)影響B(tài)7-H3.CAR T細(xì)胞中細(xì)胞毒性機(jī)制的關(guān)鍵成分TET2。

圖4：SAHA上調(diào)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路和減少免疫抑制分子的表達(dá)，例如CTLA-4和TET2，圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors

五、SAHA可增強(qiáng)異種移植模型中B7-H3.CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性

作者用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)試SAHA和B7-H3聯(lián)合治療，首先建立第0代（P0）小鼠原位細(xì)胞系。如圖5，在CAR T細(xì)胞注入后的第30天，聯(lián)合治療顯著控制了腫瘤的生長(zhǎng)，聯(lián)合治療組的凋亡癌細(xì)胞百分比、B7-H3表達(dá)水平和腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞數(shù)也最高，在SAHA和B7-H3.CAR T細(xì)胞治療組中也發(fā)現(xiàn)了比其他組更具浸潤(rùn)性的生成IFNγ的T細(xì)胞。

圖5：SAHA和B7-H3聯(lián)合的CAR-T細(xì)胞在TNBC和HNSCC異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出良好的腫瘤控制作用。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

六、結(jié)論

綜上所述，作者從人源化mab 8H9中獲得B7-H3.CAR T細(xì)胞，篩選了組蛋白脫乙?；敢种苿l(fā)現(xiàn)SAHA介導(dǎo)可以上調(diào)B7-H3在實(shí)體癌細(xì)胞中的表達(dá)以及B7-H3.CAR T細(xì)胞在人T細(xì)胞中的表達(dá)。SAHA和B7-H3.CAR T細(xì)胞的聯(lián)合后對(duì)多種類型的人實(shí)體癌的抗腫瘤活性增加。

重頭戲來了!

在這篇高分文獻(xiàn)中，作者在異體移植模型中分析腫瘤浸潤(rùn)性的生產(chǎn)IFNγ的T細(xì)胞，采用的是酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法去定量生產(chǎn)IFNγ的T細(xì)胞。采用的試劑盒是達(dá)科為的達(dá)優(yōu)系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit（cat#2110001和cat# 2110005），如下圖。

 

產(chǎn)品介紹

達(dá)科為公司的達(dá)優(yōu)^?系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit采用原裝進(jìn)口高親和力高效價(jià)抗體對(duì)，經(jīng)預(yù)包被PVDF板、低溫干燥、真空密封包裝等工藝流程制備。成品PVDF板上預(yù)包被的抗體分布均勻、效價(jià)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間從3天縮短為2天，大幅度減少無菌操作的實(shí)驗(yàn)步驟，減輕實(shí)驗(yàn)者的勞動(dòng)強(qiáng)度和減少污染的幾率，使得實(shí)驗(yàn)者能夠輕松、高效地完成復(fù)雜的ELISPOT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

■ 應(yīng)用范圍：本試劑盒專用于科研。

■ 保存條件：2-8℃可穩(wěn)定保存12個(gè)月。

齊全的產(chǎn)品

達(dá)優(yōu)系列ELISPOT試劑盒分人和小鼠兩種種屬，涵蓋多種指標(biāo)，有可拆卸和不可拆卸板條；并且也提供ELISPOT的輔助試劑和讀板服務(wù)，為您的ELISPOT實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。

參考文獻(xiàn)：

Lei, Xinyuan, et al. A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3–Specific CAR T Cells in Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 2021.

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